近日，深圳湾实验室唐啸宇课题组与中科院微生物所陈义华课题组合作在微生物组领域国际权威期刊Microbiome 发表了题为“Human-associated bacteria adopt an unusual route for synthesizing 3-acetylated tetramates for environmental adaptation”的研究论文，该研究不但阐释了人源细菌产生3-乙酰化内酰胺类天然小分子的分子机理，而且揭示了生境适应性压力可驱使不同细菌产生不同类型内酰胺类化合物以适应不同生存环境的进化策略。
Tetramates类化合物是一类含有吡咯烷-2,4-二酮环结构骨架的天然产物。该类化合物具有丰富的结构多样性及抗菌、抗病毒、细胞毒性和植物毒性等生物活性。目前从细菌、真菌或海绵中发现的数百种天然tetramates类化合物中，其特征的吡咯烷-2,4-二酮环普遍通过Dieckmann缩合的方式形成。例如，链格孢属真菌产生的tenuazonic acids（TeAs）是由杂合NRPS/PKS酶TAS1催化Dieckmann缩合所得（图1）。
变形链球菌（Streptococcus mutans）普遍存在于人类口腔中，是导致龋齿发生发展的主要条件致病菌。在前期的研究中，陈义华课题组发现约有38%的口腔变形链球菌含有muc生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster, BGC）并能够产生3-乙酰化的tetramates类化合物mutanocyclin（MUC）（图1），MUC具有抑制免疫浸润和抑制条件致病真菌白色念珠菌（Candida albicans）菌丝形成的活性。唐啸宇课题组在前期研究中证实muc基因簇不但可以产生MUC，还可以产生脂酰化的MUC产物reutericyclins（RTCs）（图1），RTCs则具有良好的抑菌功能，可以帮助变形链球菌抑制包括戈登链球菌（Streptococcus gordonii）、缓症链球菌（Streptococcus mitis）、血链球菌（Streptococcus sanguinis）等多种口腔正常革兰氏阳性共生菌，从而帮助变形链球菌争夺口腔内的生存空间。然而变形链球菌如何产生MUC和RTCs的分子机理并未被揭示。
合作团队首先经过文献分析发现，植物病原真菌来源的TeAs中的iso-tenuazonic acid与口腔细菌来源的MUC是一对对映异构体，但编码其合成的生物合成基因（簇）却截然不同，因此推测MUC和RTCs可能使用以不同于Dieckmann缩合的方式形成吡咯烷-2,4-二酮环，其具体机制值得进一步研究。另外，由于iso-tenuazonic acid与MUC的生物活性及潜在的生理功能也不相同，探究muc BGC和TAS1的分布将有助于了解细菌和真菌通过不同机制产生结构相似但活性不同的化合物的生态学意义。
图1 MUC，RTCs和TeAs的不同生物合成机制及其在宿主中的不同生态功能
随后，合作团队通过对muc BGC进行体内遗传实验和体外生化重组实验，验证其合成MUC和RTCs的分子机理。在前期工作中，陈义华团队开发了基于变形链球菌天然感受态的大片段克隆技术（NabLC），利用该技术对muc BGC进行异源表达。由于该菌株中MUC产量较低，本研究中作者首先利用NabLC技术在S. mutans UA140中对muc BGC进行了异源表达，并成功获得了高产菌株。接下来，作者针对关键结构基因mucD（编码非核糖体肽合成酶MucD）和mucE（编码聚酮合酶MucE）分别构建了突变株，在此过程中发现MucD负责产生MUC生物合成的中间产物M-283。基于MUC和M-283的结构，作者推测MucE催化M-283与丙二酰辅酶A缩合，并通过形成内酰胺键的方式产生M-307。为了验证这一假设，作者将化学合成的M-307添加至不同突变株中，发现均能恢复MUC的产生。在此基础上，作者通过体外酶学反应进一步证明了MucE的功能（图2）。
图2 MucD和MucE功能的体内、体外表征
接下来本文作者通过生物信息学分析探究了muc BGC的分布：在63株含有muc BGC核心基因mucA-E的菌株中，超过90%都分离自人体或与人类密切相关的环境。有趣的是，这些菌株中muc BGC的结构与菌株来源显示出了一定关联：从人体、家畜或灵长类动物中分离的菌株绝大多数保留了基因簇中的mucF，这意味着它们能够产生免疫调节剂MUC应对来自宿主的免疫压力；而从发酵食品和植物中分离的菌株大部分缺乏mucF，因此它们可能倾向于产生RTCs用于抑制竞争菌。此外，除了变形链球菌中，其他微生物的muc BGC周围往往伴有转座酶或重组酶编码基因，显示出水平基因转移可能在muc BGC的传播中发挥重要作用（图3）。
图3 muc样BGC的系统发育分析、结构和分布情况
唐啸宇团队在前期研究中发现RTCs由脱酰基酶MucF转化为MUC。本研究在异源表达菌株中敲除mucF-J后发现MUC的产生并不受影响（图2），暗示着S. mutans UA140中可能有其它蛋白发挥了与MucF相同的功能。这一现象表明，有的微生物可能不含muc BGC但含有mucF同源基因，可以将其它微生物产生的抑菌化合物RTCs转化为免疫调节剂MUC从而实现“解毒”功能。因此，作者通过进一步分析MucF同源蛋白的分布发现：MucF同源蛋白广泛存在于人体微生物中，且大部分菌株都不含muc BGC（图4）；含有MucF同源蛋白的菌株超过70%都来源于口腔，除了变形链球菌之外还包括放线菌属（Actinomyces）、原杆菌属（Oribacterium）、斯卡多维亚菌属（Scardovia）等口腔常见菌。此外，在少数变形链球菌的竞争菌如戈登链球菌和缓症链球菌中也存在着MucF同源蛋白。作者分别从含有和不含muc样BGC的菌株中选取了部分MucF同源蛋白进行功能验证，发现这些蛋白都能够将RTCs转化为MUC，其中包括本研究使用的异源表达宿主菌S. mutans UA140中的MucF同源蛋白（MucF140），以及来源于戈登链球菌和龋病相关病原菌Scardovia wiggsiae的同源蛋白（MucFSgo和MucFSwi）（图5）。这一结果也表明MucF同源蛋白在口腔微生物中广泛分布的生态学意义。
图4 本研究中发现的MucF同源蛋白的分布
图5 MucF及其同源蛋白的脱酰基酶功能验证
该研究主要由微生物所博士生张雨薇、深圳湾实验室副研究员廖格博士、五邑大学王敏博士（原微生物所博士）和微生物所已毕业研究生张昭等共同完成。深圳湾实验室化学生物学研究所特聘研究员唐啸宇博士和中科院微生物所陈义华研究员共同负责了该项目的指导工作。本研究得到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金委杰出青年基金项目、广东省“珠江人才计划”、深圳湾实验室启动和开放基金等项目的支持。北京大学口腔医学院的王衣祥研究员、夏斌教授和中国科学院微生物研究所的冯婕研究员为该研究的完成提供了重要帮助。
唐啸宇课题组结合化学、基因组学、合成生物学手段探究微生物相关代谢产物介导的“微生物-微生物”和“微生物-宿主” 互作，从基因和化学分子水平解析并调控生命的互作活动，为活菌药物、微生物组药物、和“新一代”小分子药物的开发奠定基础。课题组常年招收对人体微生物组代谢产物感兴趣的博士生、博士后、客座学生等科研岗位，欢迎有志于投身该领域的小伙伴加入。
原文信息：
Human-associated bacteria adopt an unusual route for synthesizing 3-acetylated tetramates for environmental adaptation
