深圳湾实验室化学生物学研究所及北京大学质谱团队与清华大学等单位合作在Nature Communications期刊发表了题为Biofunctionalized dissolvable hydrogel microbeads enable efficient characterization of native protein complexes的研究论文（Nat. Commun. 2024, 15: 8633）。该研究利用可溶性水凝胶亲和基质和非变性串级质谱开发了高效纯化表征天然蛋白质复合物的技术方案SNAP-MS，可摆脱非变性质谱对体外重构样本的依赖，将应用拓展至更大范围的生物样本，为揭示生物过程分子机制、细化临床指标提供更多维度的表征信息。

对完整蛋白复合物的分析对于蛋白功能研究具有不可或缺的意义，然而可胜任这一目标的非变性质谱、冷冻电镜等化学物理表征手段受限于前端富集纯化效率。同时，天然样本中广泛存在的糖基化等复杂修饰造成蛋白质复合物的高异质性，使其谱学信号难以解析。这些问题严重影响对低输入量天然蛋白复合物的表征能力。

2024年10月5日，深圳湾实验室化学生物学研究所及北京大学质谱团队与清华大学等单位合作在Nature Communications期刊发表了题为Biofunctionalized dissolvable hydrogel microbeads enable efficient characterization of native protein complexes的研究论文，针对上述阻碍天然蛋白复合物高效表征的问题，报道了利用可溶性水凝胶亲和基质和非变性串级质谱高效纯化表征天然蛋白质复合物的技术方案SNAP-MS (Stationary-phase-dissolvable Native Affinity Purification and Mass Spectrometric characterization）。

在非变性条件下，传统亲和纯化策略通过竞争洗脱的方式将已捕获的目标物释放回收至溶液中。这一原理决定了捕获步骤和洗脱步骤的效率难以兼顾，且大体积洗脱剂的引入影响纯化效率和产物浓度。本研究利用水凝胶材料开发了新型可溶性亲和微珠，在捕获目标蛋白复合物后可通过化学试剂或光学处理，通过使亲和珠完全溶解的方式将目标物回收至溶液中，可规避洗脱步骤对捕获效率的限制并降低洗脱剂体积，进而允许使用高亲和力配基实现高特异性、高回收率、高浓度的富集纯化（图1）。在与既有类型亲和策略（传统形式或配基连接可断裂的各类基质）的比较中，SNAP亲和珠在回收率、特异性、非特异性吸附等方面均体现了更优异的性能。

图1 SNAP-MS技术流程示意图及可溶微球制备原理

2002年诺贝尔化学奖表彰了两项生物大分子质谱离子化技术，其中MALDI因其酸性环境无法用于非共价复合物分析，而电喷雾离子化产生的多价态信号导致谱图需要通过数学变换解析，加之天然蛋白质自身具有的复杂修饰，使得天然复合物的谱图解析异常困难。本研究中富集纯化获得的蛋白复合物以目标物-配基复合物的形式存在，非共价结合的配基可在质谱分析中借助串级质谱（MS2）脱离体系。配基的存在不仅不影响目标复合物在序列、修饰、结合计量关系、复合物拓扑结构等方面的保真度，反而可在先进质谱分析策略的加持下发挥独到作用：伴随配基解离的非对称电荷分配效应和异质性过滤效应可大幅降低目标复合物离子价态、提升信号分辨，并通过解离反应的质量守恒为目标物分子量测定提供额外的约束条件，从而显著提升高异质性糖蛋白分子量测定的准确性。在对实际生物样本的分析中，SNAP-MS揭示了志愿者血液样本中结合珠蛋白（Haptoglobin）在丰度、聚集态、结合态等方面的个体差异，突破了免疫比浊等临床用传统技术仅能呈现总浓度的限制（图2）。




图2 利用SNAP-MS技术分析不同临床血样中的结合珠蛋白复合物分布


此外，针对20S蛋白酶体的测定表明SNAP-MS可针对培养皿规模蛋白表达体系中不多于1 mL培养基溶液内的蛋白进行高效纯化和快速表征，可用于表征目标复合物的降解及重排产物、揭示降解机制，并为与冷冻电镜等其它结构生物学技术的联用筛选优化表达及前处理条件，大幅提升流程效率和数据质量。


综上，本研究开发的SNAP-MS技术流程通过采用亲和基质溶解策略显著提升了富集纯化效率，提升了配基选择的灵活性；以配基-目标物复合物形式回收的产物可适配非变性质谱、冷冻电镜等表征手段，其中配基可在串级质谱中发挥电荷移除和分子量校正的双重作用，从而在上游前处理阶段为下游质谱分析植入有效工具；非变性及串级质谱分析可提供由序列至蛋白结合关系的多层次结构信息。SNAP-MS可针对实际生物样本复杂体系实现天然蛋白复合物的高效分析，并适用于高异质性的糖蛋白体系。这一技术可摆脱非变性质谱对体外重构样本的依赖，将其拓展至更大范围的生物样本分析中，为揭示生物过程分子机制、细化临床指标提供更多维度的表征信息。


深圳湾实验室化学生物学研究所邵心阳博士（现为昌平实验室助理研究员）、清华大学生命科学学院田梦博士为本文共同第一作者；清华大学生命科学学院王建斌副教授、北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）王冠博研究员为本文共同通讯作者。本工作获得了清华大学生命科学学院王宏伟教授、北京大学BIOPIC及深圳湾实验室化学生物学研究所黄岩谊教授、北京大学人民医院检验科王辉教授的大力支持。


原文信息：

Biofunctionalized dissolvable hydrogel microbeads enable efficient characterization of native protein complexes