2024年7月8日，深圳湾实验室葛韵团队和饶浪团队合作在Angewandte Chemie International Edition《德国应用化学》上发表题为“Engineered Cellular Vesicles Displaying Glycosylated Nanobodies for Cancer Immunotherapy”的研究论文。该研究提供了一种全新的、通用的、具有展示单一高甘露糖型修饰的纳米抗体细胞囊泡的方法，不仅有效地阻断了CD47/SIRPα轴，携带高甘露糖修饰还能够激活MBL补体途径，同时凭借细胞囊泡长半衰期和高肿瘤靶向的优势，最终增强抗肿瘤免疫效应。

近年来，癌症免疫疗法领域经历了显著的发展，其中包括免疫检查点阻断和CAR-T细胞疗法等，这些突破性治疗方法彻底改变了治疗癌症的方式。在这些新兴治疗策略中，CD47-SIRPα信号通路引起了广泛的关注。CD47作为一种细胞膜蛋白，通过与巨噬细胞表面的SIRPα结合，发出“别吃我”信号，使得肿瘤细胞能够避免被巨噬细胞吞噬，从而实现肿瘤免疫逃逸。这一信号通路具有巨大的治疗潜力，已成为癌症免疫治疗中备受关注的靶点之一，其前景不亚于PD-1/PD-L1靶点。相关研究表明通过阻断CD47-SIRPα的相互作用，可以增强巨噬细胞的吞噬能力，并改善肿瘤微环境，从而提高免疫疗法的疗效。然而，针对CD47的抗体药物的研发面临着挑战，其中主要是肿瘤外血液毒性和T细胞消耗等问题，且传统的单克隆抗体（mAbs）在经过糖基化后，其临床表现在疗效和安全性方面良莠不齐。纳米抗体是一种缺失轻链的单域抗体，具有分子量轻（12-15 kDa）、体积小、抗原结合力好、稳定性高、屏障渗透能力强等诸多优势。由于缺乏Fc段，纳米抗体没有传统抗体的抗体依赖细胞毒性，广泛用于癌症治疗和检测、分子探针显像、ADC药物及核素药物研发等基础和临床研究。但纳米抗体由于不含糖基化修饰，体内循环周期短，其应用也受到了限制。因此作者想在纳米抗体中引入特定的糖基化修饰，拓展其功能范围。

首先，通过基因工程和调控N-糖基化合成途径，作者发展了纳米抗体通用性的高甘露糖型修饰方法，成功将高甘露糖修饰引入抗CD47纳米抗体中，并保留其与CD47分子的高亲和力。随后，作者将这种高甘露糖修饰的nCD47展示在细胞膜表面，并利用超声波处理和机械挤压的方法，获得了高甘露糖型纳米抗体修饰的细胞囊泡HM-nCD47-CVs。HM-nCD47-CVs一方面借助抗CD47纳米抗体，有效阻断CD47-SIRPα信号通路，另一方面借助高甘露糖修饰与甘露糖结合凝集素2（MBL2）的结合，激活先天免疫系统的补体途径，多管齐下增强抗肿瘤免疫效应。同时，细胞囊泡有效克服了纳米抗体自身半衰期和循环时间短的缺点，高效实现了肿瘤部位的靶向和累积。最后，在CT26结肠肿瘤模型和4T1三阴性乳腺癌转移瘤模型中，作者均证明了HM-nCD47-CVs的优异抗肿瘤表现，呈现肿瘤微环境重塑和显著的抑瘤效果，同时保留了生物安全性。



图1 （A-C）高甘露糖修饰的纳米抗体的制备与表征；（D-E）展示高甘露糖修饰的纳米抗体的细胞囊泡的制备与表征；（F-G）该细胞囊泡在小鼠体内的肿瘤积累和半衰期



图2 HM-nCD47-CVs在小鼠肿瘤模型上的抗肿瘤表现

综上所述，我们建立了一个纳米抗体糖基化修饰的通用平台，未来有望按需引入不同数目和类型的糖基化修饰，在保留纳米抗体与抗原结合能力的基础上，丰富纳米抗体的功能表现。将纳米抗体、N糖修饰与细胞囊泡整合，可以有效克服纳米抗体半衰期短和单价糖亲和力弱的问题，极大地发挥多种功能生物分子的协同效应，体现了细胞囊泡作为有效递送载体，在其上进行蛋白和糖分子工程化，并用于活体疾病治疗上的巨大潜力。



图3 展示糖基化纳米抗体的细胞囊泡的制备及其在肿瘤免疫治疗中的应用

上述工作近日在线发表在Angewandte Chemie International Edition《德国应用化学》上，葛韵研究员和饶浪研究员为该论文的共同通讯作者，饶浪课题组博士后伍继成和葛韵课题组科研助理卢海林为该论文的共同第一作者。上述研究工作得到了国家自然科学基金、深医专项和深圳湾实验室的资助。