长期的自然进化往往赋予了天然产物优异的生物活性，因此天然产物经常作为重要的先导化合物进行药物研发。然而天然产物的结构复杂性又为药物研发带来了许多挑战。高效制备天然产物，对药物研发包括药物生产，构效关系和作用机制研究至关重要。

脱氢膜海鞘素B（商品名：普立肽）是源自海洋地中海海鞘的一种抗癌药物，在澳大利亚联合地塞米松用于复发性或难治性多发性骨髓瘤患者的治疗。此外，脱氢膜海鞘素B还可以有效抑制新冠病毒SARS-CoV-2的复制的活性。在新冠大流行期间，脱氢膜海鞘素B被西班牙制药公司PharmaMar成功推到II/III期合并临床实验阶段，显示出了巨大的抗病毒潜力。目前，脱氢膜海鞘素B的供应主要依靠化学全合成，步骤繁琐，收率很低，因此，开发新型高效的制备方法对膜海鞘素类药物的研发意义重大。




图1 脱氢膜海鞘素B和膜海鞘素B的化学结构。

虽然脱氢膜海鞘素B的天然来源尚未可知，但膜海鞘素B可由细菌Tistrella mobilis或者Tistrella bauzanensis生物合成，尽管产量很低（0.2-3.2 mg/L）。膜海鞘素B和脱氢膜海鞘素B结构相似，区别仅在于侧链乳酸基。因此，作者计划通过细菌发酵生产膜海鞘素B，再通过化学半合成制备药物脱氢膜海鞘素B。

为了实现这一目标，作者首先收集了17株Tistrella菌株，包括14株Tistrella mobilis和3株Tistrella bauzanensis。生物信息学分析发现，除了L16，其他所有菌株均含有完整的膜海鞘素B生物合成基因簇。进一步发酵培养显示，菌株L17的膜海鞘素产量最高，可达22 mg/L，并且生长速度快，pH的适应能力强。因此，作者选取L17作为菌种进一步优化。通过初步的发酵条件优化，L17的膜海鞘素B产量可达到36 mg/L。对膜海鞘素B的生物合成基因簇进行多拷贝之后，产量可进一步提高到75 mg/L，大发酵分离产量可达42 mg/L。



图2 膜海鞘素B生产菌株的基因簇分析和初步产量测试。



图3 通过多拷贝提高膜海鞘素B的产量。

在实现膜海鞘素B的发酵生产后，作者首先筛选羟基保护基TMS，对主环的羟基进行保护，然后对侧链乳酸基的羟基进行氧化，再进行脱保护，三步法制备了脱氢膜海鞘素B，总收率可达56%。为了进一步提高转化率，作者筛选了十种氧化剂，其中TEMPO反应具有优异的选择性，可以专一性的氧化侧链羟基，一步实现脱氢膜海鞘素B的制备，收率达90%以上。



图4 选择性氧化膜海鞘素B制备脱氢膜海鞘素B。

此外，为了拓展这一平台的应用，作者又对主环的羟基进行了化学修饰，制备了13个膜海鞘素B衍生物，并对其生物活性进行了测试，探究了主环羟基的构效关系。

图5 膜海鞘素B衍生物的制备和构效关系研究。

最后，为了进一步扩展该平台的应用潜力，作者通过化学半合成在膜海鞘素B上引入了具有炔基的光交联基团，制备了膜海鞘素B分子探针，通过点击化学反应对膜海鞘素天然产物的作用靶点进行了初步探究。首先作者发现，膜海鞘素B分子作用于人类白血病单核细胞系内的棕榈酰蛋白硫酯酶PPT1，这一结果与Schreiber组从牛脑裂解液中钓取的蛋白结果类似。随后，作者还发现膜海鞘素B分子探针很容易和一些细胞膜结构上的蛋白进行互作，例如：reticulon 4 (RTN4), kinectin (KTN1) 和secretory carrier-associated membrane protein 2 (SCAMP2)等蛋白，这些结果暗示膜海鞘素B可能在细胞内可结合多个蛋白靶标。



图6 膜海鞘素B作用靶点的钓取。

综上所述，唐啸宇/葛韵团队结合合成生物学和有机化学，对海洋天然产物膜海鞘素的菌株进行了筛选，发酵条件优化，基因编辑和发酵生产。在此平台基础上，作者通过化学半合成制备了商品化药物脱氢膜海鞘素B，解决了目前其化学合成繁琐、收率低的问题。此外，作者又通过化学半合成制备了膜海鞘素衍生物，进行了构效关系研究，阐明了主环羟基对活性的重要性。最后，作者通过化学半合成制备膜海鞘素分子探针，对膜海鞘素的作用机制进行了探究，验证了PPT1为其抑制癌细胞生长的一个可能的作用靶点。这一工作可能为结构复杂的天然产物研究提供一个新的范例。

上述工作近日在线发表在Angewandte Chemie International Edition，唐啸宇研究员和葛韵研究员为该论文的共同通讯作者，深圳湾实验室助理研究员张海利和客座博士生李旭阳为该论文的共同第一作者。上述研究工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省各项基金资助。唐啸宇实验室2020年底成立以来，聚焦微生物活性天然产物，围绕“新型微生物药物的药源发掘和功能探索”的关键科学问题，通过基因组挖掘、微生物组、合成生物学、化学生物学等新技术和多学科的交叉融合，探索突破该领域发展瓶颈的新思路。课题组建立至今以(共)通讯作者在Nature Metabolism, NSR, Angew Chem, Advanced Science, Microbiome, Organic Letters, ACS Chemical Biology 等领域专业杂志共发表论文11篇，申请专利1项。


原文信息：

A Semisynthesis Platform for the Efficient Production and Exploration of Didemnin-Based Drugs